走出“高濃度”樣本粒度檢測的誤區

摘要：目的：探討高濃度樣本的粒度檢測是否真正可行，探討高濃度樣本檢測所需要關注的重點，以及如何避免誤區。 方法：查閱國內外相關文獻及進行實驗驗證。 結論：濃度過高會導致檢測結果產生偏差，真正的高濃度檢測應當建立在科學的統計學意義基礎之上，并且盡量避開重合限。

關鍵詞：高濃度、粒徑檢測、粒度檢測、動態光散射（DLS）、單顆粒光學傳感技術（SPOS）。

        粒度檢測是一門嚴謹的科學，粒度檢測應當建立在科學的統計學意義基礎之上，并且盡量避開重合限。現行的粒度檢測手段主要是激光粒度儀，激光粒度儀主要分為三類：1、激光衍射粒度儀（Laser diffraction,簡稱LD），利用光衍射的物理現象，使用米氏散射理論和夫瑯禾費理論，通過數學模型計算得到粒度分布；2、動態光散射激光粒度儀（Dynamic light scattering,簡稱DLS），利用光散射的物理現象，使用斯托克斯愛因斯坦方程式（Stokes-Einstein 方程）計算得到粒度分布；3、單顆粒光學傳感計數粒度儀（Single particle optical sizing,簡稱SPOS），利用光阻（light extinction，或稱光消減）效應，得到粒子的數量和分布。

        本文試圖對高濃度樣本的檢測誤區進行分析，并試圖找到解決方案。

1、粒度檢測的兩個關鍵點

        粒度檢測主要關注的兩個關鍵點為統計學意義和重合限。這兩個關鍵點影響著檢測結果是否可靠以及是否。因為粒度檢測是一門嚴謹的科學，其呈現形式為累積分布數據。這就決定了只有足夠量的大數據才能反映樣本的整個體系，這就是統計學意義。利用光散射現象來檢測粒度的激光粒度儀，都會碰到粒子重合造成的干擾問題，盡量避開粒子的重合現象，才是得到結果的正確思路。

1.1.統計學意義

        統計學意義是在數據樣品較少的情況下，無法反映此樣品是好還是壞，只有當數據量較多，能夠反映樣品的基本情況，從而判定數據是否可靠的一種方式。簡單的說，在測量過程中，獲得的數據越多，越能證明這個測試結果越具有可靠性和有效性。美國藥典<USP729>對乳劑注射液的粒度分布做了明確規定，其中大乳粒的檢測標準是0.05%，根據我們的經驗，每次檢測中一個樣品至少需要統計到25萬個粒子才能使結果可信，換句話說才具有統計學意義。下圖1和圖2來自ISO13322-1, 粒徑分析，圖像分析方法。

圖1

圖2

可以看到，如果得到一個相對誤差5%的數據，在幾何標準偏差（GSD)1.60下，所需要檢測到的粒子數是60811個；如果相對誤差是10%，在幾何標準偏差（GSD)1.60下，所需要檢測到的粒子數是15203個。這說明如果使結果可信，必須得到足夠的數據量。

1.2.重合限

        重合限：顧名思義為顆粒的重合極限值，在此范圍之內粒子幾乎沒有重合現象。樣本中有很多顆粒，激光若照射到顆粒上會產生散射現象和光阻效應，當然哪種效應做主導是更具實際測試環境所決定的，比如顆粒大小。試想當兩個顆粒緊靠在一起，他們產生的信號將無法區分，在儀器看來，這就是一個粒子。另外光散射會在不同的粒子之間傳遞，造成多重散射現象（Multiple light scattering，簡稱MLS，如圖3所示）。在實際測試中要盡量避開上述干擾因素。

圖3

        換言之，若測試濃度超過該檢測儀器的重合限，測試結果將會產生偏差。在中國藥典中，針對于單顆粒光學傳感技術（SPOS），不溶性微粒檢測要求的重合限是10000#/ml。

        圖4解釋了何為重合限，在測試濃度在10000#/mL之前，檢測的結果與實際的樣品濃度結果十分接近，甚至可以說檢測的結果就可以代表真實結果，當超過重合限（10000#/mL）之后，檢測結果并不會因為樣品濃度的增長而增長，而是有一個下降的趨勢，原因在于儀器將兩個或多個粒子當成了一個粒子，從而造成數量減少。

圖4

下表1是針對于動態光散射（DLS）所做的八組試驗，該試驗樣品為DUKE—92nm標準粒子，測試儀器為PSS-Nicomp Z3000。我們改變其配置濃度，來監控其測試結果的變化。

表1——標準粒子不同濃度下測試結果比較

        從表1可以看出，當稀釋150倍時，所測得的平均粒徑接近標稱值。當增加或減少稀釋倍數時，檢測結果明顯變大，遠離標稱值。從而可以認為該樣品稀釋150倍的濃度下多重光散射效應低。

圖5

圖6

圖7

圖8 

圖5-8為相同樣品不同濃度的檢測結果，假設顆粒之間沒有重合現象，如果加倍稀釋的話，稀釋后的樣本粒子數量應該為稀釋前的50%。圖5為原樣檢測，它的濃度很高，超過了重合限。圖6為稀釋兩倍后的檢測結果，但是它的粒子數并沒有根據稀釋倍數的增大兩倍而下降一半。圖7為稀釋四倍后的檢測結果，這時檢測到的粒子數在63000顆左右，而當稀釋到八倍時，這時檢測到的粒子數為33000顆左右，很明顯是稀釋四倍時檢測到的粒子數的一半左右，此時的濃度在重合限之內。

2、結果與討論

        濃度過高會導致檢測結果產生偏差，真正的高濃度檢測應當建立在科學的統計學意義基礎之上，并且盡量避開重合限。但是在實際的工作、研究和學習中，不可能每個樣本濃度正合適。這就要求我們自行去尋找合適的濃度，以此來我們的測試結果、真實、可信。在ISO-22412動態光散射中，也提及需要考察濃度。在乳劑檢測標準中，無論是美國USP729還是中國的藥典都對濃度做了特別規定。

        上海奧法美嘉科技有限公司作為美國PSS粒度儀公司在中國的代表，一直于傳授粒度真知，在對高濃度樣品的檢測中，提倡進行科學有效的方法學開發及研究。而PSS粒度儀也開發了自動稀釋模塊和高性能的新一代傳感器，來應對高濃度樣本的檢測。我們深信只有遵循嚴謹科學的態度以及求真求實的原則，方能促進技術的以及產品品質的提升。